CARACTERÍSTICAS MICROBIANAS, ESTABILIDAD AERÓBICA Y CINÉTICA DE DEGRADACIÓN RUMINAL DEL ENSILADO DE PASTO SABOYA (Megathyrsus maximus) CON NIVELES CRECIENTES DE CÁSCARA DE MARACUYÁ (Passiflora edulis)

Microbial and fermentative characteristics and rumen degradation kinetics of saboya grass (Megathyrsus maximus) silage with increasing levels of passion fruit (Passiflora edulis) by-product

En las regiones tropicales, las estrategias de alimentación de los rumiantes se basan fundamentalmente en el aprovechamiento directo de los pastos, así como la utilización de los recursos disponibles localmente, tales como los residuos agroindustriales [2]. La mayor producción cuantitativa y cualitativa del pasto ocurre en la época de lluvia y los pastos no consumidos se agotan en la época de sequía y pierden valor nutritivo, limitando la productividad de las explotaciones. El ensilaje es la opción más viable, tanto para preservar forrajes y otros alimentos disponibles estacionalmente como para evitar el rápido deterioro de los subproductos agroindustriales con elevado grado de humedad, de forma que puedan suministrarse al ganado como alimento principal o complementario de los pastos durante la estación seca [5]. El proceso de ensilaje depende de la materia seca (MS), el contenido de carbohidratos solubles y la población microbiana natural del producto [32]. Los forrajes tropicales tienen un bajo contenido de MS y carbohidratos fermentables, y una elevada capacidad tampón [4, 6, 28], lo que puede afectar negativamente al ensilaje y reducir el valor nutritivo del ensilado obtenido. La adición a los forrajes tropicales de residuos del procesamiento de frutas puede aumentar la recuperación de MS y el valor nutritivo de los ensilados, probablemente debido al rápido descenso del pH por un mayor crecimiento de las bacterias acidolácticas (BAL) al disponer de abundantes carbohidratos fácilmente fermentables aportados por dichos residuos [16]. Una vez abiertos los silos, la estabilidad aeróbica del ensilado, definida como el tiempo durante el cual la temperatura permanece constante y no ocurre deterioro, se relaciona positivamente con el contenido de bacterias y negativamente con el de levaduras [31]. A su vez, el crecimiento de las levaduras durante el proceso de ensilado es inhibido por los ácidos grasos de cadena corta (láctico, propiónico y, especialmente, acético) liberados por las BAL al metabolizar los carbohidratos solubles [31].

Trabajos previos han evaluado el efecto de la inclusión del residuo de maracuyá (Passiflora edulis) fresco o desecado al sol en el ensilado de pasto elefante (Pennisetum purpureum) sobre su digestibilidad aparente [13, 23]. Sin embargo, la información referida a la degradación ruminal in situ del ensilado de pasto saboya (Megathyrsus maximus) en combinación con el residuo de la fruta de maracuyá es muy escasa. Por lo antes descrito, el objetivo del presente trabajo fue contribuir al conocimiento de la microbiología y la estabilidad aeróbica del ensilado de pasto saboya con inclusión de niveles crecientes de residuo de maracuyá, así como la cinética de degradación ruminal in situ del mismo.

La investigación se realizó en el laboratorio de Rumiología y Metabolismo Nutricional (RUMEN) de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), provincia de Los Ríos, Ecuador. El pasto saboya se obtuvo de una parcela establecida en el Campus Experimental “La María” de Facultad de Ciencias Pecuarias de la UTEQ. Se realizó un corte de igualación y se cosechó a los 45 días (d), no se realizó fertilización ni riego. El residuo de maracuyá se obtuvo en la empresa TROPIFRUTAS S.A. (Quevedo, Ecuador). Muestras representativas del pasto segado y el residuo de maracuyá se recogieron previamente al ensilaje para formar sendas muestras compuestas de cada producto, en las que se determinaron los contenidos de MS, materia orgánica (MO), cenizas y proteína bruta (PB), de acuerdo con los métodos descritos por Association of Official Analytical Chemists (AOAC) [1], y de fibra neutro detergente (FND) y fibra ácido detergente (FAD), con el procedimiento de ANKOM Technology (Macedon, NY, EUA).

Se prepararon cuatro ensilados de pasto saboya con la inclusión de 10; 20; 30 y 40% en base fresca de residuo de maracuyá. Para ello, se utilizaron 20 silos experimentales (cinco réplicas por tratamiento), construidos con tubos de policloruro de vinilo (PVC) de 30 centímetros (cm) de longitud por 10 cm de diámetro, con una capacidad de almacenamiento de 3 kilos (kg) [21], modificados para la extracción de efluentes [8]. Tanto el pasto como el residuo se picaron para reducir la longitud de las partículas por debajo de 5 cm, en una picadora de pasto (Trapp® ES 400, Brasil). El material se pesó (MOBBA BS, Mobba, Barcelona, España), de acuerdo con los tratamientos, y se homogenizó manualmente, de forma concienzuda, antes de introducirlo en los silos. La compactación fue manual, tipo tornillo, y el sellado bajo presión se realizó con patones de PVC, tornillos y cinta de embalaje. Los silos sellados se colocaron en un depósito a temperatura ambiente (26 ± 0,6 ºC), sin radiación solar directa. La apertura de los silos se hizo tras 21 d de almacenamiento. Inmediatamente tras la apertura, se determinó la temperatura de cada uno de los silos con un termómetro digital (Digital 9.2, Gessa, Urkuliz, España) introducido a tres profundidades. A continuación, se extrajeron muestras con un sacabocados artesanal de extremo biselado y 40 cm de longitud y el orificio dejado se rellenó con el propio material del silo. La muestra de cada silo se mezcló manualmente, de forma concienzuda, y se recolectaron tres submuestras de 250 gramos (g). Una de las submuestras se mezcló homogéneamente con las demás del mismo tratamiento en una única muestra para la determinación de la composición química [1].

La otra submuestra se utilizó para la determinación de pH, bacterias, hongos y levaduras [22, 25]. Una cantidad de 25 g de cada silo se homogeneizó durante un minuto (min) en 225 mL de solución estéril de Ringer al 25% para determinación del pH mediante un pH-metro digital (Crison Basic 20, Crison Instruments, Barcelona, España). La misma solución se filtró con una gasa doble estéril en matraces estériles para la preparación de diluciones seriadas (factor 10) con solución estéril de Ringer, las cuales se utilizaron para hacer las siembras por duplicado en placas de Petri con agar MRS y agar de extracto de malta. Las placas se incubaron (Memmert, Schwabach, Alemania) a 32 ºC. El período de incubación fue de 72 horas (h) para las BAL y de 120 h para los hongos y levaduras. Pasado el tiempo de incubación, las colonias se enumeraron con un contador y los valores se expresaron como log₁₀ unidades formadoras de colonia (UFC) g^-1. La estabilidad aeróbica (T y pH) se determinó diariamente durante 6 d, a la misma hora (h) y con registro de la T ambiente, en los silos. Los silos se mantuvieron cubiertos con un paño de algodón que permitió el paso del aire pero evitó la posible contaminación.

En la determinación de la degradabilidad ruminal in situ de la MS, se preparó una muestra compuesta (500 g) con alícuotas de la tercera submuestra de los silos correspondientes a cada tratamiento. La muestra se desecó en estufa (Memmert UN55, Memmert, Schwabach, Alemania) a 65ºC durante 48 h, y se molió en un molino (Model 4 Wiley Mill, Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EUA) con criba de 2 milímetros (mm). A continuación 10 g se introdujeron en bolsas de nylon de 10 x 20 cm con un tamaño de poro de 50 micrometros (μm). Por cada tratamiento y tiempo de incubación (0; 3; 6; 12; 24; 48 y 72 h), se utilizaron dos bolsas en cada uno de tres bovinos Brahman (Bos indicus) castrados (400 ± 20 kg de peso vivo), provistos de fistula ruminal. Los animales fueron alimentados con pasto saboya a discreción y fueron controlados permanentemente por los servicios veterinarios, evitando situaciones de sufrimiento y favoreciendo el comportamiento natural. Pasado el tiempo de incubación, las muestras se extrajeron del rumen, se lavaron con agua destilada, se desecaron a 65 ºC durante 48 h y se pesaron. La desaparición de la MS se ajustó según el modelo exponencial descrito por Ørskov y McDonald [17], mediante la ecuación:

p = a + b [1 – e^{–(c x t)}]

Donde, p es el porcentaje de MS que desaparece en el tiempo t; a la fracción soluble (%) por lavado de las bolsas a la hora 0; b la fracción insoluble (%) pero potencialmente degradable, y c la tasa de degradación de b^(h-1).

La degradabilidad efectiva (DEMS) se calculó para tres tasas de paso ruminal (k): 0,02; 0,05 y 0,08^h-1, de acuerdo con la ecuación:

DEMS = a + [(b x c)/(c+k)]

Donde a; b; c y k se han descrito anteriormente. Los parámetros de la cinética de degradación calcularon con el modo de resolución GRG NONLINEAR de la función SOLVER de Microsoft EXCEL®.

Todos los análisis estadísticos se hicieron con SAS 3.5 [24]. Los datos de microbiología y cinética de degradabilidad ruminal se analizaron con el procedimiento GLM, utilizando el tratamiento como efecto fijo, y las medias de mínimos cuadrados se compararon con el test de Tukey. Los datos de estabilidad aeróbica se analizaron con el procedimiento GLM, utilizando el tiempo y el tratamiento como efectos fijos. Cuando el efecto estudiado fue el tiempo, la tendencia lineal se investigó mediante contrastes polinómicos ortogonales. Adicionalmente, se realizó el test de Dunnet, utilizando como referencia el valor a 0 h, cuando el efecto lineal fue significativo. La comparación de las medias de mínimos cuadrados cuando el efecto estudiado fue el tratamiento se realizó con el test de Tukey. La significación estadística se declaró a P<0,05.

La composición química del pasto saboya y el residuo de maracuyá (TABLA I) resultaron similares a lo reportado por otros autores [4, 15, 27, 29].

TABLA I
COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL PASTO SABOYA (Megathyrsus maximum), RESIDUO DE MARACUYÁ (Passiflora edulis) Y ENSILADOS EXPERIMENTALES

¹ Inclusión de residuo de maracuyá

La combinación de residuo de maracuyá con pasto saboya tuvo pocos efectos en general sobre la microbiología del ensilado (TABLA II). Los recuentos de BAL fueron similares a los señalados en ensilados premarchitados de pasto saboya con dos niveles de humedad y con tiempos de fermentación de 15 y 30 d [20]. Sin embargo, los recuentos de hongos y levaduras obtenidos en el presente estudio (<2 UFC g-1), fueron muy superiores a los reportados por trabajos previos [20]. La microbiología de los ensilados y particularmente de las BAL presentes en los mismos es de una extraordinaria complejidad [12, 25, 26]. Las BAL juegan un importante papel en la acidificación adecuada del ensilado para frenar el crecimiento de microorganismos indeseables como clostridios, hongos y levaduras [19] y su crecimiento requiere una abundancia de carbohidratos solubles en el material a ensilar [16].

De acuerdo con los resultados obtenidos, las condiciones más favorables para el crecimiento de las BAL se dieron en el ensilado con 30% de residuo de maracuyá (P<0,05). Por otra parte, el elevado recuento de hongos y levaduras podría explicarse por una predominancia de las BAL homofermentativas productoras de ácido láctico, principalmente; frente a las heterofermentativas productoras de ácido acético y propiónico, en menor medida, al momento en que se abrieron los silos [9]. El crecimiento de las BAL heterofermentativas en el ensilado es posterior al de las homofermentativas [10], y los ácidos acético y propiónico, por su constante de disociación ácida (pKa) más elevado, son mejores inhibidores del crecimiento de los hongos y levaduras al pH de 4,3 – 4,7 típico de los ensilados [7]. No obstante, la hipótesis planteada requiere más investigaciones.

TABLA II
CARACTERISTICAS MICROBIANAS DE SILOS DE PASTO SABOYA (Megathyrsus maximum) CON RESIDUO DE MARACUYÁ (Passiflora edulis)

¹ Inclusión de residuo de maracuyá^a,b,c Las medias de mínimos cuadrados sin un superíndice común son significativamente diferentes (P<0,05).EEM: Error estándar de la media.

En la TABLA III se muestran los valores de T y pH durante los 6 d posteriores a la apertura de los silos. La T no fue diferente (P>0,05) entre tratamientos en el transcurso del tiempo. Sin embargo, la temperatura aumentó (P<0,05) y tendió a aumentar (P=0,06) con el paso de los días en los tratamientos con 30 y 40% de residuo de maracuyá, respectivamente. Por otro lado, todos los tratamientos mostraron un incremento de T superior a 1 ºC únicamente en el último día del estudio, lo que indicaría que todos tuvieron la misma respuesta a la exposición al aire [9].

TABLA III
ESTABILIDAD AERÓBICA DE MICROENSILADOS DE PASTO SABOYA (Megathyrsus maximum) CON RESIDUO DE MARACUYÁ (Passiflora edulis)

¹ Temperatura^a,b,c Dentro de cada hora, las medias de mínimos cuadrados sin un superíndice común son significativamente diferentes (P<0,05) entre tratamientos.^A,B Dentro de cada tratamiento, las medias de mínimos cuadrados con un superíndice son significativamente (P<0,05) mayores (A) o menores (B) en comparación con la hora 0. EEM: Error estándar de la media.

Tanto el tratamiento como el tiempo tuvieron efectos importantes sobre los valores de pH. A la apertura de los silos, el pH fue mayor y menor (P<0,05) en los ensilados con 10 y 40% de maracuyá, respectivamente, y la diferencia se mantuvo prácticamente en todos los días del estudio. El pH aumentó linealmente (P<0,05) en todos los tratamientos, de forma que al final del estudio los valores registrados duplicaron a los observados a la apertura de los silos; de hecho, el incremento de pH fue mayor de 0,5 puntos al segundo día (d) de exposición aeróbica en todos los tratamientos, lo que indica una elevada inestabilidad aeróbica [30]. El deterioro aeróbico de los ensilados es un proceso microbiológico complejo en el que los productos de la fermentación, como el ácido láctico, y los carbohidratos solubles residuales sirven de sustrato para el crecimiento de bacterias aeróbicas, hongos y levaduras. Como resultado de la oxidación de los sustratos, la T del ensilado aumenta, a la par que el catabolismo del ácido láctico, con el consecuente incremento del pH [19]. Recuentos de hongos y levaduras >5 log₁₀ UFC g^-1 y más del 70% de agua en el material vegetal fresco se relacionan negativamente con la estabilidad aeróbica [3, 21] y podrían explicar los resultados observados en el presente trabajo.

Los parámetros de la cinética de degradación ruminal in situ de la MS y los valores de degradabilidad potencial y efectiva se muestran en la TABLA IV. La inclusión de residuo de maracuyá en el ensilado no tuvo efectos (P>0,05) sobre las fracciones soluble y potencialmente degradable, la tasa de degradación horaria y la degradabilidad potencial. Por el contrario, la DEMS fue claramente mayor (P<0,05) en los ensilados con los niveles más altos de inclusión de residuo de maracuyá, lo que sugiere que la MS de dichos ensilados fue mejor utilizada por los microorganismos ruminales, probablemente debido a su mayor proporción de solubles en detergente neutro (SND = 100 – FND) [27]. Más aún, de acuerdo con los resultados de Júnior y col. [11], una parte los SND del residuo de maracuyá debieron ser pectinas, cuya degradabilidad ruminal debió ser prácticamente total según observaciones previas [14]. El aumento de la DEMS indica una mejora del valor energético del ensilado con la inclusión de residuo de maracuyá para los rumiantes, que puede estimarse en 0,5 megajulios (MJ)/kg MS [18].

TABLA IV
CINÉTICA DE DEGRADACIÓN RUMINAL IN SITU DE ENSILADOS DE PASTO SABOYA (Megathyrsus maximum) CON RESIDUO DE MARACUYÁ (Passiflora edulis)

¹ Inclusión de residuo de maracuyáEEM: error estándar de la media; MS: materia seca; a: fracción soluble; b: fracción potencialmente degradable; c: tasa de degradación de b; DP: degradabilidad potencial (a+b); DEMS: degradabilidad efectiva de la materia seca a tasas de paso ruminal del 2, 5 y 8% h-1.^a,b,c Las medias de mínimos cuadrados sin un superíndice común son significativamente diferentes (P<0,05).

La combinación de entre 10 y 40% sobre peso fresco de residuo de maracuyá con pasto saboya no tuvo efectos importantes sobre la microbiología. En todos los tratamientos, se observó una baja estabilidad aeróbica. La degradación ruminal fue mayor en los ensilados que incluyeron 30 y 40% de residuo de maracuyá, lo indicaría un mayor valor nutritivo. El ensilado de pasto saboya con residuo de maracuyá podría ser una forma eficiente y aceptable medioambientalmente de disponer de alimentos para sostener la productividad de los rebaños bovinos en la temporada seca. Sin embargo, la elevada inestabilidad aeróbica debe ser tenida en cuenta a la hora de manejar los ensilados para evitar pérdidas materiales y nutritivas.

A la Universidad Técnica Estatal de Quevedo por su financiamiento a través del Fondo Competitivo de Investigación Ciencia y Tecnología (FOCICYT) en el Proyecto Caracterización de ensilajes de pasto Saboya (Megathyrsus maximu) con inclusión de residuos agroindustriales tropicales de uso alimenticio del bovino de doble propósito, y a la Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología (SENESCYT).