HTML

ePub

PDF

INTRODUCCIÓN

Las respuestas de los ratones (Mus musculus domesticus) de laboratorio, en las distintas experiencias que se les utilizan pueden estar influenciadas, por sus características genéticas y la condición sanitaria de los mismos [10]. Los tipos genéticos de los ratones producidos en los bioterios son esencialmente dos: los consanguíneos y los no consanguíneos. Los primeros son obtenidos de una pareja única y reproducidos hermanos con hermanas por veinte generaciones, de manera que los caracteres genéticos adquiridos son fijados en un linaje estable a través del tiempo. Los segundos, pertenecientes al grupo no consanguíneo, son ratones pertenecientes a una misma colonia entre los cuales existen variaciones genéticas. Éstos son reproducidos usualmente de forma de minimizar la consanguinidad, que solo debería aumentar 1% cada cuatro generaciones, lo que puede ser logrado usando diferentes esquemas de reproducción [3, 9].

En relación a la condición sanitaria de los animales de laboratorio producidos en bioterios convencionales, el parásito intestinal Syphacia obvelata tiene una alta incidencia [23, 25, 26, 27]. La susceptibilidad del hospedador al parásito depende de factores intrínsecos, tales como: sexo, edad y condición genética [3, 18]. S. obvelata, pertenece a la clase Nematoda, a la superfamilia Oxyuroidea, familia Oxyuridae. Este parásito, habita el ciego del hospedador y tiene un ciclo de vida directo, de aproximadamente 11 a 15 días; las hembras grávidas depositan sus huevos en la región perianal en un promedio de 350 huevos, éstos se vuelven infectivos entre las cuatro y seis horas (h); la vía de infección, generalmente, es oral [4, 7]. Se piensa que no es patogénico [8], sin embargo, las infecciones con nematodos han sido asociadas con prolapsos rectales, enteritis mucoide e impacción intestinal [24]. Más recientemente, ratones infectados con nematodos demostraron una auto-tolerancia y la importancia en la inducción neonatal de la respuesta a enfermedades autoinmune asociadas a Th2 y células T de memoria [1, 26].

Ha sido reportada la existencia de diferentes respuestas a parásitos dependiendo del tipo genético de los ratones usados en la investigación. Algunos trabajos han reportado que los ratones BALB/c, del tipo genético consanguíneo presentan mayor susceptibilidad a la Leishmania major, que los C57BL/6, los cuales son también del tipo genético consanguíneo [12], y a Trypanosoma cruzi [6]. Esta diferencia de susceptibilidad tiene su origen en el contraste genético relacionado con la capacidad de los ratones C57BL/6 de producir interleucina 4 (IL-4), la cual dirige la diferenciación de las células Th2, esta diferenciación genética es propuesta como determinante en la susceptibilidad de los ratones BALB/c [5]. Más recientemente ha sido reportado que, los ratones BALB/c producen una respuesta inmunológica contra Trichuris muris similar a la respuesta Th2, la cual permite al ratón ser capaz de modificar la respuesta al parásito, en contraste con el ratón AKR, que produce una respuesta Th1 siendo éste severamente afectado [22]. En el caso de las infecciones por Taenia crassiceps se ha postulado que, la diferencia en susceptibilidad para cisticercoides múrido está asociado con factores genéticos y sexuales, encontrando que el ratón hembra es más susceptible en los estados iníciales de la infección, mientras en infecciones avanzadas la susceptibilidad de ambos sexos es similar [13], identificándose como relevante el papel directo de la respuesta inmunológica del hospedador, en la diferencia de la susceptibilidad entre ambos sexos. Se reporta también la presencia de la respuesta inmune Th2 en ensayos experimentales con BALB/c infectados con S. obvelata, identificando la respuesta inmunológica con la producción de Ig G (IgG1) parásito específica, con elevada producción transitoria de interleucinas 4 (IL-4), IL-5, e IL-13[20].

El objetivo del presente trabajo fue comparar la susceptibilidad de los ratones consanguíneos BALB/c//BIOU y C57BL/6//BIOU y no consanguíneos BIOU:NMRI producidos en el bioterio de la Universidad de Los Andes - Venezuela, a infecciones experimentales por S. obvelata, usando como variables dependientes la prepatencia de la parasitosis, la medición de las concentraciones séricas de Ig G contra antígenos de S. obvelata y la valoración del posible daño histológico a nivel del intestino grueso, órgano blanco del parásito. La finalidad del trabajo es ofrecer a los usuarios información con respecto a la influencia que tienen las parasitosis comunes a los ratones que son usados como modelos experimentales, sobre distintos parámetros que son medidos en los experimentos en que estos participan.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Se utilizaron ratones consanguíneos C57BL/6, BALB/c y no consanguíneos NMRI, los cuales en este trabajo son nombrados como: BALB/c//BIOU, C57BL/6//BIOU y BIOU:NMRI por ser producidos en el bioterio de la Universidad de Los Andes (BIOULA) y caracterizados en las condiciones de este bioterio: a) producidos en aisladores (AlyTec®, CENPALAB, Cuba), a 23 ± 2°C, b) alimentados a voluntad con alimento pasteurizado a 121°C / 1 minuto (min), c) agua de bebida esterilizada a 121 °C/ 2 min.; y d) material de encamado cáscara de arroz (Oryza sativa), esterilizada a 121 °C/ 15 min, en autoclave a vapor de doble puerta, marca BAUMER modelo HI VAC MX II, fabricada en Brasil; e) temperatura de la habitación y humedad de 23 ± 2°C y 65 ± 10%, respectivamente; f) ciclos de iluminación de 12 h luz: 12 h oscuridad y con una intensidad de luz de 180 Luxes.

Después del destete, los animales fueron distribuidos por sexo en cajas piso sólido, tipo T2 (40 centímetros (cm), altura x 25 cm, ancho x 25 cm, largo, en donde se alojaron cinco animales por caja.

Diseño experimental

Se establecieron tres grupos experimentales. El primero (grupo parasitado experimentalmente) consistió de 60 animales, veinte pertenecientes a cada tipo genético (10 machos y 10 hembras).

Cada ratón fue parasitado con 10 huevos maduros (infectivos) de S. obvelata, que fueron recolectados mediante el método del hisopo húmedo de la región perianal de los ratones infectados, éstos se colocaron en 200 µL de solución fisiológica mediante sonda gástrica de acero inoxidable (cánula pájaros 1.2 mm curva 5 cm, España), después del destete. Antes de la inoculación, los ratones fueron diagnosticados libres de parásitos, mediante la prueba convencional del método de Graham [15], la misma se realizó diariamente durante 1 semana (sem) para comprobar que estaban negativos a S. obvelata. Además que en el bioterio semestralmente (Procedimientos Normatizados de Trabajo), los ratones alojados en los aisladores son monitoreados para parásitos y bacterias. El segundo grupo (grupo control) igualmente contentivo de 60 animales, fue establecido de la misma forma que el grupo experimental pero sin parasitar.

El tercer grupo consistió de 20 ratones parasitados naturalmente, pertenecientes a la colonia no consanguínea, este grupo se utilizó para: a) obtener los huevos con los que se realizó la infección de los animales experimentales, b) obtener los gusanos que se prepararían como antígeno para sensibilizar las microplacas de titulación, y c) para obtener el suero positivo para el análisis serológico.

Los animales se alojaron en el aislador a periodos diferentes, iniciando con el grupo control de los tres tipos genéticos, posteriormente se continuó con los animales del grupo experimental. El tercer grupo se alojó en un cubículo sin barreras sanitarias, con agua, alimento y material de cama sin esterilizar, con la finalidad de que se parasitaran naturalmente [1].

Diagnóstico de parasitosis

Los ratones de los grupos experimentales se monitorearon semanalmente a partir de la primera semana de parasitados con los huevos de S. obvelata, usando el método convencional o método de Graham, el cual consiste en colocar un corte de cinta adhesiva transparente en la apertura del ano del ratón haciéndole presión, luego ésta se coloca sobre un porta objeto y se observa en un microscopio, marca Nikon, modelo Eclipse LVison, EUA; con el objetivo de 10X. A la par, se usó el procedimiento del hisopo húmedo (limpieza perianal), la cual consiste en frotar un hisopo húmedo con solución fisiológica el área perianal del ratón y luego se coloca en una gota gruesa de esta misma solución sobre un portaobjeto, se coloca un cubre objeto sobre la muestra y se observa al microscopio, observando la apariencia del parásito y realizando el contaje.

A la sexta sem los animales fueron sacrificados usando la cámara de anestesia con Euflorano 100% [19], verificando el estado de inconsciencia mediante el pinchazo podal. Una vez que el animal se encontraba inconsciente se realizó la extracción de aproximadamente 1 mL de sangre vía intracardíaca, con cavidad torácica abierta. La sangre fue colectada en tubos de ensayo sin anticoagulante, para obtener el suero y realizar un Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA: acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), [15], posteriormente se realizó la necropsia con la finalidad de extraer fragmentos del intestino grueso, los cuales fueron fijados en formaldehido neutro, para su posterior procesamiento mediante técnica convencional y tinción mediante hematoxilina - eosina (H - E), para su estudio histológico.

Ensayo inmunoenzimático

Para el análisis serológico, los parásitos fueron obtenidos desde el tracto digestivo de la estructuraanatómica denominada: ciego, de los ratones del grupo parasitado naturalmente [15]. Estos fueron lavados 5 veces con 30 mL de Buffer Fosfato Salino (del inglés: Phosphate-Buffered Saline; PBS), pH 8,1 y gentamicina (80 mg / 2mL), obteniendo un conjunto de parásitos libres de bacterias corroborado por observación al microscopio, los cuales fueron congelados (Thermo Scientific™ Ultracongeladores verticales de -40°C Forma™ serie 7000, España), a -40°C.

Posteriormente descongelados y centrifugados en una centrifuga refrigerada modelo OPR 6000, Thermo Scientific Sorvall ST 8, España), a 448 G x 5 Min. Se recolectó el sedimento contentivo de los parásitos en un solo tubo y se le adicionó formalina neutra y 10 mL de PBS 7,2 de pH. El sedimento fue resuspendido en 2 mL de PBS más 2 µL de mezcla de inhibidores de proteasas (TLCK, Tosyl-LLysine-chloromethylketone 62 µg/mL, TPCK, Tosyl-L-Phenylalanine-chloromethylketone 62 µg/mL y PMSF, Phenylmethylsulfonil fluoride 219 µg/mL) para evitar la degradación de las proteínas. Luego se congelaron los parásitos durante 12 h hasta su uso.

La disrupción de los parásitos fue logrado usando un sonicador (Brason sonifier modelo 150, EUA) a una frecuencia de 7 Hertz y 5 ciclos por 20 seg., alternando con un minuto (min) de descanso en hielo, luego se procedió a colocar una gota sobre un portaobjeto para observar al microscopio el rompimiento de los parásitos.

La cuantificación de proteínas fue realizada por el método colorimétrico de Bradford [21], usando una reacción colorimétrica visible del colorante (Comassie G- 250), leída en un espectrofotómetro (Dynatech MR5000, Microplate reader, EUA) a una longitud de onda de 595 nm, de las proteínas crudas obtenidas después de la disrupción de los parásitos. Para obtener la concentración de proteínas presente en cada una de las muestras, se dividió el valor de la absorbancia obtenido de cada muestra entre 0,06 relacionado a los microlitros utilizados de la muestra analizada.

Para obtener el suero positivo se obtuvo la sangre sin anticoagulante, aproximadamente 1,0 mL, mediante punción cardíaca del grupo de ratones parasitados naturalmente; para lo cual se centrifugó a 3360 G durante 5 min en una centrifuga marca FaNem modelo 206, Brasil; éste se conservó una vez obtenido en una nevera ejecutiva marca Frigilux modelo Nvr 276, Venezuela, a 4°C hasta su uso. El suero negativo fue obtenido de la sangre sin anticoagulante de los ratones alojados en los aisladores, antes del sangrado los ratones fueron diagnosticados como libres de parásitos, mediante el método convencional de Graham y mediante examen del contenido del ciego; la garantía de que estos ratones se encuentran libres de parásitos se fundamenta en que semestralmente los ratones alojados en los aisladores son monitoreados bacteriana y parasitológicamente. Ambos sueros se colocaron en tubos eppendorf de 1,5 mL y fueron guardados a 4°C, en una nevera ejecutiva marca Frigilux modelo Nvr 276, Venezuela, hasta su uso.

La cuantificación de IgG se realizó mediante un ELISA indirecto, siguiendo lo propuesto por Huapayai y col. [17] la prueba se hizo por duplicado, los pocillos de las placas microtituladoras (Nunc Maxi-SorpImmuno Plate) fueron sensibilizadas con extracto crudo de S. obvelata, a una concentración de 1 µg diluido en 100 µL de buffer de unión o buffer carbonato. Las placas fueron incubadas a 4 °C por 8 h, tapadas para evitar la evaporación, en una nevera ejecutiva marca Frigilux modelo Nvr 276, Venezuela. Luego fueron lavadas tres veces con PBS al 0,005% de Tween 20 (PBS-T) por 10 min cada lavado, sacudiéndola vigorosamente sobre un papel absorbente, para eliminar el antígeno no absorbido a la placa. Posteriormente fueron bloqueadas con 200 µL/pozo con PBS más caseina 2% e incubada por 60 min a temperatura ambiente, con el fin de bloquear los sitios libres de proteínas en el plástico, luego las placas fueron lavadas tres veces más con PBS al 0,005% de Tween 20. Se adicionó en cada pozo 100 µL del suero diluido con caseína 2% colocando en los pocillos las siguientes diluciones: 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 y 1:800 volúmenes. Las placas fueron incubadas durante una hora (h) a temperatura ambiente y se realizaron tres lavados de 10 min cada uno, con PBS al 0,005% de Tween 20. Luego se le adicionó el conjugado IgG (anti-ratón de Sigma A9044 – 2 mL) peroxidasa a una dilución de 1:7500 con PBS caseina 2% en un volumen de 100 µL por pocillo e incubado por una h, se volvieron a realizar tres lavados con PBS al 0,005% de Tween 20, y luego se adicionó el ortofenil dietanolamina (OPD 0,02%) con peróxido de hidrógeno al 30% y buffer citrato pH5, incubándose posteriormente en la oscuridad por 45 min. La reacción fue detenida al adicionar solución de H2SO4 al 20%, y leída utilizando un filtro de lectura a 490 nm, en un lector de ELISA Marca BioTek, Modelo ELx808, EUA. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado.

Análisis estadístico

Los valores obtenidos fueron sometidos a un análisis estadístico de correlación utilizando un “software” estadístico especializado (SPSS) versión 12.0 año 2002, con un 95% de confiabilidad.

De acuerdo al objetivo del trabajo, se planteó como hipótesis nula (Ho) la ausencia de diferencias significativas en los parámetros medidos entre los tipos genéticos evaluados, usando el análisis estadístico ANOVA con un P < 0,05.

Este estudio fue evaluado por el Comité de Ética de los animales de laboratorio de la Universidad de Los Andes (Comité de Ética Bioterio Universidad de Los Andes: CEBIOULA), siguiendo los lineamientos para el cuidado y uso de los animales de laboratorio propuestos en el Manual para el uso y cuidado ético de los animales de laboratorio de la Asociación Venezolana de la Ciencia de los Animales de Laboratorio (cuyo acrónimo es AVECAL), [2].

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La TABLA I, presenta el período prepatente de los huevos a la cuarta sem post inoculación y las distintas formas del parásito (huevos, larva y adultos – hembra y machos) de S. obvelata a la quinta sem postinoculación, en los ratones hembras y machos de los diferentes genotipos en estudio. Se observaron diferencias significativas (P = 0,002) entre las distintas formas y las cantidades del parásito entre los tres tipos genéticos evaluados a la quinta sem de la experiencia.

Observándose similitud con lo reportado en la bibliografía que señala que la parasitosis por S. obvelata está influenciada por la condición de género animal [18]. La presencia de huevos se percibió a partir de la cuarta sem, luego de la infección, encontrándose diferencias en la cantidad de huevos entre los grupos.

Al ser el parasitismo un fenómeno biológico interdependiente y dinámico, la infección puede provocar escasas manifestaciones; sin embargo, el estado inmunitario del huésped siempre da una respuesta, debido a la misma dinámica de los eventos que ocurren en el establecimiento de la infección.

En relación a la prueba de ELISA, se consideraron valores seropositivos, en el límite de positividad o el punto de corte, aquellos resultados cuya densidad óptica superaba la media del valor negativo más 2 desviaciones estándar, el punto de corte estuvo comprendido entre un rango de 0.0035 - 0.024, entonces se consideraron positivos todos los sueros que dieron niveles de anticuerpos mayores a esta máxima lectura de densidad óptica. De esta manera se diferenció entre sueros negativos y positivos.

La FIG. 1 presenta los resultados de las absorbancias obtenidos con las distintas diluciones del suero de los ratones machos de los tres tipos genéticos analizados. En ésta se pueden observar que los valores de la absorbancia, de las cinco diluciones de los sueros de los ratones de la cepa consanguínea BALB/c//BIOU fueron los más altos aún en la menor titulación de 1:50 la cual fue de 0,15 ± 0,01. Seguido por los valores de la línea de de ratones BIOU: NMRI (0,17 ± 0,01 a 0,13), presentando la menor concentración de IgG los ratones de la cepa C57BL/6//BIOU (0,14 ± 0,02 a 0,12 ± 0,01). Todos los tipos genéticos presentaron una respuesta inmunológica a la presencia del parásito. Las absorbancias obtenidas para los sueros de los ratones controles negativos se mantuvieron por debajo de 0,02 ± 0,01.

La FIG. 2 presenta las absorbancias a las distintas diluciones (1:50; 1:100; 1:200; 1:400 y 1:800) de los sueros de las hembras de los tres tipos genéticos involucrados en el estudio, observándose que para las hembras de la cepa BALB/c //BIOU éstas se encontraron dentro del rango de absorbancia de 0,17 ± 0,02 a 0,15 ± 0,01 en relación a las diluciones realizadas, siendo este rango el más alto en relación a los rangos encontrados para el suero de los otros grupos de ratones. Las diluciones del suero de la línea BIOU: NMRI presentaron las medidas en el rango de 0,15 ± 0,01 a 0,13 ± 0,01 y finalmente los presentados para las hembras de la cepa C57BL/6//BIOU se encontraron entre el rango 0,14 ± 0,02 a 0,12 ± 0,01. El rango de absorbancia de la IgG para los ratones controles se mantuvo en el 0,02± 0,01. Al igual que se observó para los machos, todos los sueros evaluados de los tres tipos geneticos tuvieron una respuesta inmunológica a la presencia del parásito.

En la FIG. 3 se pueden observar las microvellosidades del ciego, donde se pueden observar criptas de Lieberkühn profundas (flecha completa) y microvellosidades alargadas (punta de flecha) y relativamente finas, que presentaron los animales controles de los tres tipos genéticos.

En la FIG. 4 se pueden observar las microvellosidades del ciego, donde se pueden observar criptas de Lieberkühn poco profundas (flecha completa) y microvellosidades aplanadas (punta de flecha) y relativamente gruesas, que presentaron los animales parasitados de los tres tipos genéticos. Observándose en el tejido de los ratones C57BL/6//BIOU, no sólo alteración de la profundidad de las criptas sino distorsión de la morfología apical de las microvellosidades.

Una de las características de la especie S. obvelata, es que se encuentra altamente distribuida en los ratones que se producen en los bioterios convencionales [11, 16, 20], si no son diagnosticados estos parásitos, pueden interferir en el desarrollo de protocolos y alterar la interpretación final de los resultados [14].

La producción de IgG en parasitosis producidas por parásitos intestinales ha sido reportada por varios autores [15, 20]. En este trabajo se compararon las absorbancias encontradas a cinco diluciones distintas (1:50; 1:100; 1:200; 1:400 y 1:800) del suero de los ratones con características genéticas distintas parasitados con S. obvelata. Encontrándose que los ratones del tipo genético consanguíneo, BALB/c//BIOU, presentaron los mayores valores de absorbancia aún a las menores titulaciones (1:50), tanto para machos como para hembras. Siendo el suero de los ratones C57BL/6//BIOU, los que presentaron los valores más bajos en relación a la menor titulación, pero similares al que se reporta para otros parásitos específicamente, L. major [12].

El comportamiento observado en los ratones no consanguíneos (BIOU:NMRI), presentando valores intermedios observados entre los ratones consanguíneos BALB/c//BIOU y C57BL/6//BIOU, tanto en relación a la concentración de IgG y el inicio de la infección (TABLA I; FIG.2), indican un comportamiento intermedio en relación a la parasitosis con S. obvelata.

Es importante considerar que en los ratones C57BL/6//BIOU, no se observaron en el órgano blanco, el ciego, los parásitos adultos [26] durante el tiempo del estudio, sin embargo, éstos se observaron en la porción distal del intestino delgado, no siendo usual de estas parasitosis. También se pudo observar que, a pesar de que estos ratones son de un tipo genético consanguíneo, fueron los que presentaron menor susceptibilidad al parásito. La adaptación de un parásito a un determinado microambiente es consecuencia de la expresión de diversas moléculas que intervienen en la capacidad de obtener y utilizar recursos del hospedero (espacio y nutrientes) para lograr su supervivencia y reproducción. Algunas de estas moléculas tienen capacidad antigénica y evocan respuestas efectoras que limitan la diseminación y multiplicación parasitarias, otras son efectivas como mecanismos de evasión de la respuesta inmune, para lograr determinar con mayor precisión el comportamiento de invasión de un microambiente distinto al observado comúnmente para S. obvelata, se necesitan realizar estudios diferentes a los reportados en este trabajo.

La mayor susceptibilidad del tipo genético consanguíneo al parásito S. obvelata podría estar relacionada a con la inducción de una respuesta inmune transitoria del tipo Th2 con elevada producción de citoquinas IL-4, IL-5, e IL-13 y la inmunoglobulina parásito específica IgG1. En contraste el ratón BALB/c es deficiente en IL-13, IL-4/13, o de los receptores cadena alfa de IL-4 por lo que desarrolla una enfermedad crónica con una mayor carga parasitaria y una falla en la respuesta Th2 [20].

Las concentraciones de IgG fueron mayores en los ratones machos en comparación con el de las hembras, coincidiendo con los reportes bibliográficos, de que los machos presentan mayor susceptibilidad al parásito [18].

En la evaluación de la histología del tejido del órgano blanco se pudo observar aplanamiento de las vellosidades del tejido del ciego del intestino grueso en los ratones BALB/c//BIOU (tipo consanguíneo) y de los ratones BIOU:NMRI (tipo no consanguíneo). En el caso del C57BL/6//BIOU se observó distorsión en las vellosidades no se observa a una estructura conservadas a nivel del glucocálix de la histología del ciego del C57BL/6//BIOU (tipo consanguíneo), a pesar de que se observó una menor susceptibilidad en relación a los otros tipos genéticos, indicando que la presencia de los parásitos en el órgano blanco produjeron daño.

CONCLUSIÓN

Los resultados conducen a concluir que los ratones BALB/c//BIOU presentan una mayor susceptibilidad a S. obvelata en relación a los ratones del tipo genético no consanguíneo NMRI:BIOU y a los ratones del tipo consanguíneo C57BL/6//BIOU, ya que éstos fueron los primeros en presentar un periodo de prepatencia más corto, además de presentar los valores más altos de absorbancias en la titulación más baja, a pesar de que todos los sueros evaluados presentaron concentración de IgG a la presencia del parásito S. obvelata.

Referencias

[1] AGERSBORG, S.; GARZA, K.; TUNG, K. Intestinal parasitism terminates self tolerance and enhances neonatal induction of autoimmune disease and memory. Eur. J. Immunol. 31:851-859. 2001.

[2] AVECAL. Organización y funcionamiento de los bioterios. En: Manual para la producción y uso ético de los animales de laboratorio. MPPyT, Pp 15-38.2008.

[3] BENAVIDES, F.; GUENÉT, JL. Las líneas genéticamente estandarizadas y los controles de pureza. En: Manual de genética de roedores de laboratorio. Principios básicos y aplicaciones. Universidad de Alcalá. Lab Animal. Ltd. SECAL, Pp 105 – 124. 2003.

[4] BAZZANO, T.; RESTEL, T.; PINTO, R.; GOMES, D. Patrones de infección con los nematodos de S. obvelata y A. tetráptera en ratones de tipo convencional. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 97:97-113. 2002.

[5] BIEDERMANN, T.; ZIMMERMANN, S.; HIMMELRICH, H.; GUMY, A.; EGETER, O.; SAKRAUSKI, A.; SEEQMÜLLER I.; VOIGHT, H.; LUNIOS, P.; LEVINE, A.; WAGNER, H.; HEEQ, K.; LOUIS, J.; RÖCKEN, M. IL-4 instructs TH1 responses and resistance to Leishmania major in susceptible BALB/c mice. Nat. Immunol. 2:1054-1060. 2001.

[6] CARDONI, M.; ANTUNEZ, M.; ABRAMI, A. Respuesta Th1 en la infección experimental con Trypanosoma cruzi. Med. (Buenos Aires). 59 (Supl. II): 84-90. 1999.

[7] CHAN, K. Life cycle studies on the nemtode Syphacia obvelata. Ame. J. Hyg. 56(1):14-21. 1952.

[8] CHESNEY, M.; GOYAL, P.; NIEUWENHUIZEN, N.; BROMBACHER, F. Infection with Syphacia obvelata (pinworm) Induces Protective Th2 Immune Responses and Influences ovalbumin – Induced Allegic Reactions. Infect. Immunity. 74(10): 5926–5932. 2006.

[9] DE JESÚS, R.; RODRÍGUEZ, N.; TORRES, W.; MORENO, Y.; O’CALLAGHAN, J. Uso de marcadores moleculares microsatélites para determinar condición de homocigosis y heterocigosis en roedores producidos en el Bioterio de la Universidad de Los Andes, Venezuela. AIA. 15: 45-63. 2011.

[10] DE JESÚS, R.; PAVÓN, W. Sinergismo en la respuesta inmune en ratones BALB/c//BIOU con parasitosis combinadas: Syphacia obvelata y Lehismania mexicana. Spei Domus. 21(10): 29-39.2015.

[11] DOYLE, R.; GONZÁLEZ, S.; LÜHERS, D.; MORAES, J.; SCHAFER, A.; BERTOLIN, K. Avaliação helmintológica de camundongos (Mus musculus) criados em biotério experimental. Uruguaiana. 13:108-115. 2006.

[12] FALÚE, M.; GARCÍA-BUSTOS, M.; PARODI C.; MOLINA De R.; CARDOZO, R.; CIMINO, R.; BASOMBRÍO, M. Susceptibilidad de distintas cepas de ratones a la infección por Lehismania amazonensis. Dermatol. Argent. 15: 334–339. 2009.

[13] FRAGOSO, G. Factores del huésped y del parásito implicados en la susceptibilidad a la cisticercoides experimental murina por Taenia crassiceps. 2006. Actividades académicas. 13era. Mesa Redonda. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. CisTiMex. En Línea: http://www.lab.biomedicas.unam.mx/cistimex/s714.html. 21 /10 /2015.

[14] GONCALVES, L.; PINTO, R.; VICENTE, J.; NORONHA, D.; GOMES D. Helminth parasites of conventionally maintained laboratory mice - II. Inbred strains with an adaptation of the anal swab technique. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 93: 121-126. 1998.

[15] GUDIÑO, M.; DE JESÚS, R.; OSORIO, A.; URDANETA, H.; ALFONZO, N.; MORA, Y.; O’CALLAGHAN, J. Implementación de la técnica inmunoensayoenzimática ELISA como método de diagnóstico para la detección de Syphacia obvelata en ratones producidos para uso experimental. Rev. Latinoam. Parasitol. 68:86-91. 2009.

[16] HINRICHSEN, L.; DI MASSO, R. Empleo de un modelo murino original de Argentina en la caracterización de fenotipos complejos. BAG. J. Basic Appl. Genet. 21(2):1-12.2010.

[17] HUAPAYAI, P.; ESPINOSA, I.; UAIZA, A.; SAVILLA, C. Estandarización de la técnica de ELISA para diagnóstico de Estrangiloidiosis. An. Fac. Med. Univ. Nac. Mayor de San Marcos. 63 (3):179-184.2002.

[18] KLEIN, L. Mecanismos hormonales e inmunológicos que median las diferencias de sexos en la infección por parásitos. Parasit. Immunol. 26: 247 – 264. 2004.

[19] MARTÍNEZ, M.; BUZALEH, A.; BATLLE, A. Efecto de los anestésicos Enflurano e Isoflurano en ratones con niveles inducidos y deprimidos de citocromo p450: estudios sobre el sistema enzimático metabolizante de drogas. Acta Bioq. Clin. Latinoam. 39:37-42. 2005.

[20] MICHELS, C.; GOYAL, P.; NIEUWENHUIZEN, N.; BROMBACHER, F. Infection with Syphacia obvelata (Pinworm) Induces Protective Th2 Immune Responses and Influences Ovalbumin-Induced Allergic Reactions. Infect. Immun. 74: 5926–5932. 2006.

[21] NOBLE, J.; KNIGHT, A.; REASON, A.; DI MATOLA, A.; BAILEY, M. A comparison of protein quantitation assays for biopharmaceutical applications. Mol. Biotechnol. 37(2):99-111. 2007.

[22] PATEL, N.; KREIDER, T.; URBAN, J.; GAUSE, W. Characterization of effect or mechanisms at the host: parasite interface during the immune response to tissue-dwelling intestinal nematode parasites. Int. J. Parasitol. 39: 13-21. 2009.

[23] PARKINSON, C.; O’BRIEN, A.; ALBERS, T.; SIMON, M.; CLIFFORD, C; PRITCHETT-CORNING, K. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. 55:e2767. 2011.

[24] PLACHY, V.; LITVINEC, A.; LANGROVA, I.; HORA´KOVA, B.; SLOUP, V.; JANKOVSKA, I.; VADLEJCH, J.; ADKOVA, Z.; BORKOVCOVA, M. The effect of Syphacia muris on nutrient digestibility in laboratory rats. Lab. Anim. 50(1) 39–44. 2016.

[25] PRITCHETT, K.; JOHNSTON, N. A review of treatments for the eradications of pinworm infections from laboratory rodents colonies. JAALAS. 41:36-46. 2002.

[26] SATO, Y.; NONAKA, N.; OKU, Y.; KAMIYA, M. Antibody Production in Syphacia obvelateInfect. Mice. J.Parasitol.81:559-562.1995.

[27] SCAINI, C.; TRAVERSI, M.; RHEINGANTZ, M.; SIGNORINI, V.; TEIXEIRA, M. Helmintos de ratas Wistar de diferentes faixas etarias criados en bioterio convencional. Arq. Inst. Bio. 3:265-268.2003.

IR