INTRODUCCIÓN

El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad multisistémica crónica, mediada inmunológicamente¹, que se caracteriza por la producción de autoanticuerpos y la presencia de infiltrado linfocitario en las glándulas exocrinas. En esta enfermedad, se produce el deterioro progresivo de las glándulas exocrinas salivales y lagrimales (exocrinopatías), manifestándose con sensación de sequedad de las mucosas orales (xerostomía) y oculares (queratoconjuntivitis sicca). Sin embargo, a través del proceso inflamatorio, pueden afectarse otros órganos, desarrollando diversas alteraciones sistémicas como fatiga, artralgia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, glomerulonefritis, entre otras².

El SS es la segunda enfermedad autoinmune más frecuente, afectando entre el 0,1 al 3% de la población mundial³. El SS afecta con mayor frecuencia a mujeres entre la cuarta y quinta década de vida, con una relación de 9:1 respecto de los hombres⁴.

El diagnóstico del SS se realiza aplicando diferentes criterios. Uno de los criterios utilizados es del consenso Americano-Europeo del 2002, que consta de 6 parámetros, 4 objetivos y 2 subjetivos. El análisis histopatológico de glándulas salivales y la presencia a nivel sérico de autoanticuerpos anti-Ro, y anti-La, son fundamentales para la clasificación diagnóstica⁵, ya que al menos uno de estos criterios debe estar presente para que el paciente se clasifique como SS.

Desde un punto de vista histológico las glándulas salivales (GS) de estos pacientes presentan acúmulos de células inflamatorias, constituidos por poblaciones celulares que varían de acuerdo con la severidad de las lesiones⁶. Las células inflamatorias más abundantes son los linfocitos T y B, correspondientes al 90% de la población celular, mientras que 10% restante lo componen los macrófagos (Mø), células dendríticas y natural killers⁷. Los mecanismos que subyacen al grado de infiltración y predominio celular del infiltrado entre los pacientes no han sido descritos. Sin embargo, se ha asociado el grado de infiltración con la presencia de manifestaciones sistémicas extraglandulares, sugiriendo que estos pacientes constituyen un subfenotipo más severo de la enfermedad⁷. Dentro de las complicaciones extraglandulares más severas que pueden presentar los pacientes SS, es el mayor riesgo de desarrollar neoplasias malignas⁸, existiendo una asociación con el desarrollo de linfomas de tipo no Hodgkin. Se ha reportado que entre un 4,3%-5% de los pacientes SS podrían padecer esta neoplasia⁹.

Los Mø forman parte del sistema fagocítico mononuclear. De acuerdo a su fenotipo funcional los Mø se clasifican en “M1”, con cualidades microbicidas, antitumorales y potentes productores de factores proinflamatorios; y los “M2” que presentan funciones antiinflamatorias y regulan el proceso de reparación tisular¹⁰.

Los Mø se encuentran en bajo porcentaje en los infiltrados inflamatorios de GS de pacientes con síndrome de Sjögren. Sin embargo, estos producen y liberan mediadores inflamatorios que se asocian con daño en el tejido glandular¹¹. Los Mø se reclutan con anterioridad a los linfocitos en las GS, como se ha observado en modelos animales, promoviendo de esta forma un mayor reclutamiento de células inflamatorias¹². Por otro lado, los Mø son potentes productores de citocinas bajos condiciones inflamatorias y contribuyen al proceso autoinmune local.

Zhao et al. ¹³ observaron que los Mø que infiltran las GS de pacientes SS, eran positivos para CXCL13+, una quimiocina que recluta a las células B que expresan CXCR5 y a las células T foliculares auxiliares. Esto favorecería el desarrollo de centros germinales ectópicos. Además, evidenciaron un recuento elevado de Mø (CXCL13+), asociado a mayor infiltración linfocítica glandular.

Adicionalmente, diferentes autores muestran que la proporción de Mø es bastante variable. Sin embargo, Mannousakis et al encontraron un aumento en el número de Mø en el infiltrado de GS menores de pacientes SS, relacionado con un aumento de volumen de las glándulas salivales mayores (parotidomegalia)¹⁴ e hipocomplementemia C4¹⁴. Mientras que Christodoulou et al lo relacionó con el desarrollo de linfomas⁷.

El Virus Epstein-Barr (VEB) es un ADN virus de la familia del Herpes (HHV-4), que se transmite por la saliva, con una seroprevalencia a nivel mundial de un 95%¹⁵. El VEB emplea el receptor CD21 para infectar y permanecer en las células B durante toda la vida del individuo, debido, entre otras cosas, a que posee un eficaz mecanismo de evasión inmunitaria¹⁶. El VEB puede desempeñar un papel en el desarrollo del SS ya que presenta tropismo por las GS y linfocitos B, favoreciendo el desorden autoinmunitario e induciendo la apoptosis celular. Estos eventos benefician el desenmascaramiento antigénico que conduciría a la activación de células T y B autorreactivas, a través de un proceso denominado “mimetismo molecular”¹⁷. Varios estudios han reportado un aumento en la presencia del VEB en GS menores de pacientes SS comparados con individuos controles^18,19, mientras que otros no lo han evidenciado²⁰.

De acuerdo a estos antecedentes, el objetivo de este estudio fue identificar las presencia de macrófagos e infección por el VEB en el infiltrado inflamatorio de glándulas salivales labiales de pacientes SS. Adicionalmente, se evaluó la asociación entre el número de macrófagos y el compromiso inflamatorio de las biopsias de GS labiales de pacientes SS.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes y Controles

La muestra fue reclutada por conveniencia. La glándulas salivales labiales (GSL) fueron obtenidas de 15 individuos. Ocho pacientes fueron diagnosticados con síndrome de Sjögren primario siguiendo los criterios de clasificación propuestos por el Consenso Americano-Europeo del 2002⁵ y siete individuos controles, que presentaban sintomatología sicca (xerostomía y ojo seco), y que no cumplían con los criterios de clasificación diagnóstica para SS (ver Tabla 1) y cuyo estudio histopatológico de la glándula salival labial era normal o presentaba sialoadenitis crónica difusa leve. Se excluyeron individuos con radioterapia de cabeza y cuello, Infección por virus de la hepatitis C, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, linfoma preexistente, sarcoidosis, enfermedad de injerto contra huésped o que utilizaran medicamentos anticolinérgicos.

Tabla 1:
Características demográficas, clínicas, serológicas e histopatológicas de pacientes SS e individuos controles

DS: Desviación estándar. SC: Sialoadenitis crónica inespecífica. SF: Score de foco. Número de focos/4mm²

	Controles	Pacientes SS
N° de Individuos	7	8
Sexo, N° (Mujer/Hombre)	6/1	8/0
Edad, (x ̅ ± DS)	49,7 ± 7,1	49,9 ± 12,1
Xeroftalmia, n (%)	2 (28,6%)	8 (100%)
Xerostomía, n (%)	1 (14,3)	8 (100%)
Flujo Salival NE, (x ̅ ± DS)	2,5 ml ± 1,2	0,15 ml± 0,3
Ro+, n (%)	1 (14,3%)	7 (87,5%)
La+, n (%)	0 (0%)	6 (75%)
Fr+, n (%)	0 (0%)	4 (50%)
ANA+, n (%)	2 (28,6)	7 (87,5%)
Score de Foco
Normal	1	0
SC	6	0
SF. 1	0	4
SF. 2	0	3
SF. 3	0	1

Previo a la biopsia, los pacientes firmaron un consentimiento informado, aprobado por el comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile (Nº 010 - 2016) y del Servicio de Salud Metropolitano Oriente.

Biopsias

Las GS labiales se obtuvieron en ambos grupos, mediante la técnica descrita por Daniels et al²⁰. El procedimiento fue realizado por el mismo operador (SG). Se recolectaron las glándulas y fueron fijadas inmediatamente en para-formaldehído tamponado al 1% e incluidas posteriormente en parafina.

Detección de Macrófagos y VEB

Análisis inmunohistoquímico de macrófagos (CD-68) y de la proteína de fase latente de membrana 1 del VEB (LMP-1):

Las muestras fueron desparafinadas por medio de EZ Prep^® y calor e hidratación con buffer Reaction Buffer^®; se realizó la recuperación antigénica, por 1 hr. con Ultra CC1^® (Buffer Tris pH 7,6 ± 0,2); y se inhibió la actividad de la peroxidasa endógena con H2O2; a continuación, se agregó el anticuerpo primario incubado en instrumento BenchMark ULTRA, por 16 minutos a 37 °C para CD-68 (Confirm anti-CD68 (KP-1), Roche Tissue Diagnostics) y a 36°C por 80 minutos para LMP-1 (CS1-4, Cell Marque, Sigma-Aldrich). Finalmente, se utilizó el sistema de detección ultraView™ Universal DAB Detection Kit^® (antiCD-68) y OptiView DAB IHC Detection Kit^® (anti LMP-1). La contratinción se realizó con Hematoxylin II (Roche Tissue Diagnostics)^®, por 8 minutos para CD-68 y 12 minutos para LMP-1 y postcontratinción con Bluing Reagent (Roche Tissue Diagnostics^®), por 8 minutos.

Hibridación in situ para detectar al Virus de Epstein-Barr

Se realizó hibridación in situ para identificar el ARN no codificante del VEB denominado EBER. Posterior a la desparafinación e hidratación, se realizó el acondicionamiento celular utilizando CC1^® (buffer Tris pH 7,6 ± 0,2), 100°C, durante 64 mins. Se aplicó proteasa ISH 2, por 16 minutos. A continuación, se aplicó la sonda INFORM EBER Probe (Roche Tissue Diagnostics), y posteriormente se detectó mediante el sistema ISH iVIEWBlue Detection Kit (Roche Diagnostics^®). Finalmente se efectuó la contratinción con Red Counterstain II (Roche Tissue Diagnostics), durante 4 minutos.

Se utilizó como control positivo para la detección de LMP-1 y EBER secciones de linfoma de Hodgkin y linfoma T/NK, ambos VEB+, respectivamente.

Recuento células positivas para macrófagos y VEB:

- El recuento se realizó manual e independientemente, por dos observadores ciegos. Ambos observaron la glándula completa correspondiente a cada placa con un aumento de 40x, con el fin de identificar macrófagos o células inflamatorias infectadas por VEB. Se utilizó el software Image J (http:// imagej.nih.gov/ij/) para determinar el número total de células inflamatorias presentes en cada glándula. Se consideraron como positivas aquellas células cuya morfología correspondía con la descrita para los macrófagos²¹. El recuento fue realizado tanto de aquellos macrófagos presentes en el infiltrado inflamatorio difuso de pacientes SS y controles, así como en el infiltrado periductal de las GSL de pacientes SS.

- Se utilizó la siguiente ecuación para determinar la proporción de macrófagos en cada lámina:

Nº total de macrófagos

Nº total de células inflamatorias *100

Análisis Estadístico:

Una vez contabilizadas las células, se determinó el promedio y la desviación estándar en cada grupo y se compararon. Se realizo test Shapiro-Wilks para evaluar normalidad de los datos obtenidos. En los datos que presentaron distribución normal se utilizó el test t Student no pareado, mientras que en aquellos datos que no presentaron distribución normal se utilizó el test de Mann-Whitney. Los análisis de correlación se realizaron obteniendo el coeficiente de correlación de Pearson. Se utilizó el programa STATA v 16.0 y se fijó una significancia estadística de 0.05.

RESULTADOS

Aumento en el número de Mø en el foco inflamatorio de GSL de pacientes SS

La glicoproteína CD68 se encuentra en la membrana plasmática y citoplasma de Mø y monocitos. En GS labiales de pacientes SS y controles, observamos que la señal inmunohistoquímica se encontró en ambas localizaciones en células que presentan morfología de Mø (Figura 1 A). Sólo un individuo fue negativo para la inmunotinción.

Al analizar la localización que presentaban los Mø en las GS labiales de los pacientes SS, estos se encontraban dispersos en el estroma glandular y en el foco inflamatorio periductal (Figura1 B y C). En los individuos controles, Los Mø se distribuyeron de manera dispersa en toda la GS labial (Figura 1 D y E).

Figura 1
Identificación de macrófagos en biopsias de glándulas salivales labiales de pacientes SS e individuos controles. Imágenes representativas mostrando inmunodetección de CD68 (café) en secciones de GSL. A. Microfotografía representativa a 100X, en la que se destaca la señal del anticuerpo localizada a nivel citoplasmático y de membrana en una célula con positividad para anti CD-68 (flecha), correspondiente a un macrófago. B y C. Imagen representativa en un paciente SS, mostrando un intenso infiltrado inflamatorio periductal con un gran número de macrófagos. D y E, imagen representativa en un individuo control, donde se observan escasos Mø dispersos en el tejido glandular.

Al comparar el número de Mø entre ambos grupos, se encontró que los pacientes presentaron 9 veces más Mø que los controles (valor-p=0.001) (Tabla 2, Figura 2A). El número de células inflamatorias totales también fue mayor en pacientes en comparación con controles (valor-p=0,002)(Tabla 2, Figura 2B). Posteriormente, se comparó la proporción de Mø presentes en las glándulas salivales labiales de pacientes SS e individuos controles, no encontrando diferencias significativas (valor-p=0,5) (Tabla 2).

Figura 2
Análisis de la presencia de macrófagos y células inflamatorias entre pacientes SS e individuos controles. A Comparación del total de Mø entre ambos grupos. B Comparación del total de células inflamatorias entre ambos grupos. C Comparación de la proporción de macrófagos/ células inflamatorias, teniendo en cuenta distinta localización entre ambos grupos. D Correlación de la presencia de macrófagos asociados al infiltrado inflamatorio.

Tabla 2:
Comparación Nº de macrófagos y células inflamatorias y sus respectivas proporciones.

* Test t Student no pareado. ** Test de Mann-Whitney

	Controles n=7	Pacientes SS n=8	Valor-p
Macrófagos, x ̅ ± DS	3,3 ± 3,5	31,7 ± 22,6	0,001**
Células inflamatorias, x ̅ ± DS	127,3 ± 85,6	773,6 ± 373,8	0,002*
Proporción de Mø/Céls. Inf, x ̅ ± DS	3,1± 2,6	3,9 ± 1,6	0,5*

Al comparar la proporción de Mø dispersos (fuera del foco periductal) en las GS labiales de los pacientes SS y el total de Mø (dispersos en toda la glándula) en individuos controles, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (valor-p=0,7) (Figura 2 C). Además, al comparar la proporción de Mø en el foco inflamatorio periductal versus los dispersos en el estroma glandular en los pacientes SS, encontramos una mayor proporción de Mø en el infiltrado periductal (valor-p=0,04) (Tabla 3, Figura 2 C). Cabe destacar el gran infiltrado inflamatorio disperso que también presentan los pacientes SS (Tabla 3).

Tabla 3:
Relación entre Nº de macrófagos y células inflamatorias según ubicación en el infiltrado inflamatorio de GSL de pacientes SS.

* Test t Student no pareado. ** Test de Wilcoxon

	Foco inflamatorio	Dispersas	Valor-p
Macrófagos, x ̅ ± DS	18,0 ± 15,37	13,75 ± 10,38	0,4*
Células inflamatorias, x ̅ ± DS	305,25 ± 193,29	468,37 ± 214,05	0,02*
Proporción de Mø/Céls. Inf, x ̅ ± DS	6,67 ± 5,11	2,73 ± 1,48	0,04**

El aumento en el número de Mø se correlaciona con el grado de inflamación glandular.

Al correlacionar el número de macrófagos con el número de células inflamatorias, coincidente con un mayor score de foco, observamos que a medida que aumenta el grado de inflamación es mayor el número de Mø, aumento que es estadísticamente significativo (r=0,83; valor-p=0,01) (Figura 2D). Si bien las células inflamatorias aumentan tanto en el foco como dispersas, el incremento de Mø es fundamentalmente a expensas de su aumento en el foco inflamatorio periductal. Adicionalmente, encontramos que, a mayor edad, disminuyen en nuestra muestra el número de células inflamatorias en ambos grupos (r=-0,643 en pacientes, valor-p=0,08) y disminuye el número de Mø en los pacientes SS (r=-0,52 en pacientes, valor-p=0,18).

Inmunodetección negativa para el VEB en pacientes SS

Al analizar por medio de hibridación in situ (EBER) e inmunohistoquímica (LMP-1) las biopsias de GSL de los individuos controles (n=7) y pacientes SS (n=8), no se detectó la presencia del VEB, al compararlos con sus respectivos controles positivos (Figura 3).

Figura 3
Identificación de marcadores de virus Epstein-Barr en glándulas salivales labiales de pacientes SS. Microfotografías representativas que corresponden a una biopsia de un paciente SS, en las que no se observa infección por el VEB. A-C Corresponden a Hibridación in situ EBER: A: 20X, B:40X se observa sialoadenitis linfocítica focal y C: control positivo de la técnica (marcación nuclear, azul), que corresponde a un Linfoma T/NK. D-E Microfotografías correspondientes a inmunohistoquímica de la proteína latente de membrana 1 (LMP-1). D: 20X, E: 40X se observa sialoadenitis linfocítica focal y F: control positivo de la técnica (marcación citoplasmática, café) que corresponde a un Linfoma No Hodgkin.

DISCUSIÓN

En nuestro trabajo encontramos que los pacientes SS presentaron un mayor número de células inflamatorias y de Mø con respecto a los individuos controles, al igual que lo reportado por Christodoulou et al⁷. Estudios previos de biopsias de GS labiales de pacientes SS, demostraron que las células más abundantes que conforman los infiltrados inflamatorios periductales, corresponden a linfocitos T en estadios iniciales, y linfocitos B, que incrementan a medida que es mayor la severidad de la respuesta inflamatoria¹⁴. Estos linfocitos constituyen el 90% del infiltrado celular en los pacientes SS. Dentro del 10% restante, encontramos a los Mø en el infiltrado inflamatorio de pacientes SS, que se han asociado inicialmente a lesiones más severas o infiltrados inflamatorios con formación de estructuras tipo centros germinales⁷.

El aumento de Mø fue similar al encontrado en otros reportes, sin embargo, en estos se analizaron las poblaciones celulares inflamatorias que se encuentran en la totalidad de la GS, sin diferenciar aquellas células relacionadas al foco inflamatorio de las que se encuentran dispersas en el tejido glandular^6,7,14,22. Nosotros determinamos la localización y distribución de los Mø, teniendo en cuenta el foco inflamatorio periductal, y aquellos que se encontraban dispersos en la glándula, con el fin de determinar si el aumento de Mø encontrado en los pacientes, era a expensas del infiltrado inflamatorio periductal o al infiltrado inflamatorio disperso.

Al observar la distribución que presentaban los Mø en los pacientes SS, estos se encontraban en el infiltrado inflamatorio disperso y periductal. Sin embargo, los Mø se distribuyeron principalmente en el infiltrado periductal (Figura 2). Esto coincide con lo reportado por Ciccia et al²³ y Manoussakis et al¹⁴.

Las biopsias de nuestros pacientes SS, junto con los acúmulos celulares inflamatorios periductales (sialoadenitis linfocítica focal), presentaron, además, un importante número de células mononucleares dispersas en toda la muestra, como lo reportado por Llamas-Gutiérrez et al²⁴. La proporción de macrófagos dispersos en las GSL, fue semejante entre individuos controles y pacientes SS. Los pacientes SS presentaron diferencias al comparar los porcentajes de Mø localizados en el foco con aquellos dispersos. Por lo que, el incremento de los macrófagos en los pacientes SS, fue a expensas de aquellos localizados en el foco inflamatorio. Es por esta razón que los pacientes con mayor score de foco presentaron un mayor número de Mø.

Al relacionar la edad con el número de Mø en nuestros pacientes, se observó que los individuos más jóvenes presentaban un mayor infiltrado inflamatorio y de Mø, coincidiendo con los resultados obtenidos por Ramos-Casals et al. ²⁵ Ellos concluyeron que los pacientes SS jóvenes, se asociaban con una mayor presencia de desórdenes linfoproliferativos y parótidomegalia, factores asociados a un mayor riesgo de desarrollar linfomas en pacientes SS. Por otro lado, Kapsogeorgou et al, realizaron un estudio histopatológico analizando biopsias de pacientes SS efectuadas en dos oportunidades, con una diferencia promedio de 55 meses, no encontrando diferencias en las poblaciones celulares que componían el infiltrado inflamatorio ni en la severidad de estos. Es importante señalar que, durante el intervalo de tiempo entre la primera y segunda biopsia, los pacientes recibieron tratamiento médico²².

En un estudio de Christodoulou et al⁷, encontró que la presencia de Mø fue significativamente mayor en los infiltrados de GS labiales de pacientes SS que desarrollaron linfoma tipo MALT (Tejido linfoide asociado a mucosa). Este resultado es similar a lo publicado por Manoussakis et al ¹⁴, quienes reportaron que los pacientes SS presentan mayor número de Mø por sobre los individuos controles. Este incremento, lo asociaron al aumento de volumen de glándulas salivales mayores y a hipocomplementemia C4. Estos parámetros clínicos y serológicos se describen como factores de riesgo para el desarrollo de linfomas en pacientes SS. De los 21 pacientes SS que estudiaron Manoussakis et al, 1 paciente desarrolló linfoma de tipo MALT, y al analizar su biopsia de GS se demostró un score de foco de 12, y una gran presencia de Mø. Si bien ninguno de los pacientes SS de nuestro estudio ha desarrollado linfomas, es necesario determinar el número de Mø, el que se ha establecido como un factor de riesgo histopatológico de desarrollo de linfoma en estos pacientes.

Con respecto al Virus de Epstein-Barr, no detectamos la presencia del virus en las biopsias de pacientes SS (n=8) ni en las de los individuos controles (n=7). El reporte de Croia et al¹⁹, reportó la presencia de células infectadas por el VEB, en biopsias que presentaron centros germinales ectópicos asociados a intensos infiltrados inflamatorios. La posible explicación a la ausencia del VEB en nuestra muestra puede atribuirse a la ausencia de estructura tipo centros germinales ectópicos en las GSL analizadas, además, ninguno de los pacientes había desarrollado un linfoma hasta la fecha del estudio. Se siguiere realizar los mismos análisis en biopsias de pacientes SS que presenten estructuras tipo centro germinal o en aquellos pacientes que hayan desarrollado linfoma.

Nuestro trabajo presenta ciertas limitaciones tales como el reducido número de pacientes estudiados, y sólo haber identificado mediante inmunomarcación macrófagos y no otras poblaciones celulares que conforman el infiltrado inflamatorio. Es necesario continuar investigando las poblaciones de células inflamatorias en los pacientes SS, teniendo en cuenta su localización y además, las diferentes interleuquinas que interaccionan entre estas células y las células epiteliales en la GSL. El obtener esta información permitirá relacionar estos hallazgos con características clínicas de los pacientes, como el ESSDAI, con el fin de establecer el riesgo potencial de desarrollo de linfomas en estos pacientes.

CONCLUSIÓN

Los pacientes con síndrome de Sjögren presentaron mayor presencia de macrófagos con respecto a los individuos controles. Este incremento es a expensas de los macrófagos presentes en el foco inflamatorio. El aumento de los macrófagos se correlaciona directamente con el grado de infiltración inflamatoria en las glándulas salivales labiales de los pacientes SS. En nuestra muestra no detectamos infección del virus Epstein-Barr en ningún individuo.

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Notas

Notas de autor

* Correspondencia Autor: Sergio González | Dirección: Alameda 2013, Santiago, Chile. | Teléfono: +56(2) 2328 1771 | E-mail: sergio.gonzalez@mayor.cl

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